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白細(xì)胞分類計數(shù)參考方法
Reference leukocyte differential count method
前 言
為了保證白細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果具有溯源性和準(zhǔn)確性，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。
本標(biāo)準(zhǔn)修改采用了美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）頒發(fā)的《白細(xì)胞分類計數(shù)參考方法和儀器評價方法》標(biāo)準(zhǔn)（H20-A）。
本標(biāo)準(zhǔn)從20XX年XX月XX日起實施。
本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B和附錄C都是規(guī)范性附錄。
本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部醫(yī)政司提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由上海市臨床檢驗中心負(fù)責(zé)起草。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：胡曉波、許蕾、宋穎、方心馳、張錦鋒。 本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托衛(wèi)生部臨床檢驗中心負(fù)責(zé)解釋。
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了建立白細(xì)胞分類計數(shù)參考方法中有關(guān)樣本采集、血涂片制備的要求、血涂片染色、血涂片有核細(xì)胞檢查的步驟、對檢驗人員的要求和考核等內(nèi)容。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于建立的實驗室
2 總則
2.1 本標(biāo)準(zhǔn)采用手工目視顯微鏡計數(shù)法作為白細(xì)胞分類計數(shù)的參考方法。
2.2 為了保證參考方法檢測結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性，建立參考方法的實驗室必須進(jìn)行比對。
3 方法
3.1 樣本采集
將靜脈血采集于EDTA－K2抗凝劑（液體或粉末狀）中（濃度為每毫升血液含1.5～2.2mg EDTA－K2·H2O）。采血后立即混勻，應(yīng)拒絕分析有肉眼可見凝塊的樣本。
3.2 血涂片制備和要求
3.2.1 血涂片制備
3.2.1.1 每份樣本制作3張血涂片。要求所用玻片清潔、干燥、無塵，大小為25 mm×75mm，厚度為0.8～1.2mm。并有明確標(biāo)記。如果樣本中白細(xì)胞數(shù)量少時，需要制備更多血涂片（如6張）。
3.2.1.2 使用EDTA－K2抗凝血液樣本時，應(yīng)在采集后4小時內(nèi)制備血涂片。在制片前，樣本應(yīng)充分混勻。注意，樣本不能冷藏。
3.2.1.3 用楔形技術(shù)制備血涂片。在玻片近一端1/3處，加一滴（約0.05ml）充分混勻的血液，握住另一張較狹窄的、邊緣光滑的推片，以30º～45º角使血滴沿推片迅速散開，快速、平穩(wěn)地推動推片至玻片的另一端（見圖1）。
3.2.1.4 在1小時內(nèi)，用Romanowsky類型染液染色；或在1小時內(nèi)，用無水甲醇（含水量﹤3%）固定后染色。
3.2.2 良好血涂片的要求
3.2.2.1 血膜至少長25mm，至玻片兩側(cè)邊緣的距離至少為5mm。
3.2.2.2 血膜邊緣要比玻片邊緣窄，且邊緣光滑，適用于油鏡檢查。
3.2.2.3 血細(xì)胞從厚區(qū)到薄區(qū)逐步均勻分布，末端呈方形或羽毛狀。
3.2.2.4 血膜末端無粒狀、劃線或裂隙。所有這些情況會使白細(xì)胞集中在這些區(qū)域內(nèi)。
3.2.2.5 在鏡檢區(qū)域內(nèi)，白細(xì)胞形態(tài)應(yīng)無人為異常改變。通常，隨著保存時間的延長，抗凝血會造成白細(xì)胞形態(tài)的改變，如胞漿內(nèi)形成空泡，核分解破裂等。應(yīng)將抗凝血液保存時間的影響減小到zui低限度。除部分淋巴細(xì)胞增生性疾病外，鏡檢區(qū)域內(nèi)破損白細(xì)胞量應(yīng)<2％。
3.2.2.6 無人為污染。
3.3 血涂片染色
采用Romanowsky類染料染色。Romanowsky類染料由亞甲藍(lán)和/或亞甲藍(lán)氧化產(chǎn)物（天青B），和鹵化熒光素（通常為伊紅B或Y）組成。良好的染色能準(zhǔn)確鑒別成熟和未成熟白細(xì)胞或異常細(xì)胞。
3.3.1 染料的性能
Romanowsky類染料的質(zhì)量直接影響染色效果。在pH6.4～7.0條件下，染料與細(xì)胞中特定成分（細(xì)胞核和細(xì)胞漿特殊顆粒）相互作用，產(chǎn)生典型的顏色，如細(xì)胞核染深紫色，紅細(xì)胞染鮮亮的橙紅色。
3.3.2 可接受的染色qing況
粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞必須能顯示清晰的核漿分界，能識別核染色質(zhì)成分和細(xì)胞漿的顏色差異。
3.4 需分類的外周血有核細(xì)胞
外周血可見多種有核細(xì)胞。常見的有：中性分葉核粒細(xì)胞、中性桿狀核粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、異型淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。外周血中正常白細(xì)胞的形態(tài)描述見附錄A。 外周血中少見的其他有核細(xì)胞在專業(yè)的血液學(xué)教科書和圖譜中均有描述，本標(biāo)準(zhǔn)中不再敘述。
3.5 血涂片檢查步驟
3.5.1 血涂片顯微鏡檢查
3.5.1.1 首先在低倍鏡下（10倍～40倍）進(jìn)行瀏覽，觀察有無異常細(xì)胞和細(xì)胞分布情況。然后，在100倍油鏡下，觀察細(xì)胞漿內(nèi)的顆粒和核分葉情況。
3.5.1.2 檢查從約50％的紅細(xì)胞互相重疊區(qū)域開始，向紅細(xì)胞*散開的區(qū)域推移。血涂片較薄的區(qū)域，呈羽毛狀，為“血片邊緣”。
3.5.1.3 中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分布均勻的區(qū)域為血涂片分類“可接受”區(qū)域。當(dāng)白細(xì)胞總數(shù)正常時，在血涂片尾部和邊緣，每油鏡視野所見的白細(xì)胞數(shù)量不超過血涂片體部的2～3倍。
3.5.1.4 除某些病理情況（如慢性淋巴細(xì)胞白血病）外，破碎細(xì)胞或不能識別細(xì)胞的數(shù)量不超過白細(xì)胞總數(shù)的2%。若破碎細(xì)胞仍能明確鑒別（如破碎的嗜酸性粒細(xì)胞）應(yīng)包括在分類計數(shù)中。在結(jié)果報告中，應(yīng)設(shè)其他欄，以備填寫破碎細(xì)胞或不能識別細(xì)胞，并作適當(dāng)描述。
3.5.2 計數(shù)方法
3.5.2.1 采用“城垛式”方法檢查血涂片（圖1）。每個明確識別的細(xì)胞必須歸入下列分類中：中性分葉核粒細(xì)胞；中性桿狀核粒細(xì)胞；淋巴細(xì)胞；異型淋巴細(xì)胞；單核細(xì)胞；嗜酸性粒細(xì)胞；嗜堿性粒細(xì)胞；其他有核細(xì)胞（除有核紅細(xì)胞外）。能明確識別的破碎細(xì)胞，應(yīng)恰當(dāng)分類。
3.5.2.2 每張血涂片應(yīng)計數(shù)200個白細(xì)胞，若樣本中白細(xì)胞數(shù)量減少，應(yīng)增加檢查血涂片的數(shù)量。
3.5.2.3 白細(xì)胞分類結(jié)果以百分率和值表示。
3.5.2.4 計數(shù)所有的有核紅細(xì)胞，結(jié)果以每100個白細(xì)胞計數(shù)中見到幾個表示。
3.6 檢驗人員要求和考核
3.6.1 檢驗人員的要求
3.6.1.1 檢驗人員的經(jīng)驗
檢驗人員必須能對所有常見白細(xì)胞進(jìn)行分類，并了解大多數(shù)白細(xì)胞的形態(tài)異常，包括先天性和獲得性。參與細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的檢驗人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，并具備實際工作經(jīng)驗。
3.6.1.2 檢驗人員的態(tài)度
檢驗人員的工作態(tài)度、動機和專心程度是關(guān)鍵因素。因為白細(xì)胞分類計數(shù)是一項主觀性很強的工作，影響分類計數(shù)的因素很多，有檢驗人員的態(tài)度、實驗室環(huán)境條件和工作量等。對于以每張血涂片計數(shù)200個白細(xì)胞的參考方法工作量來說，每天每個檢驗人員血涂片檢驗數(shù)量約為15～25張。
3.6.2 血涂片考核
3.6.2.1 考核樣本
選擇10份樣本。樣本必須包含7種類型白細(xì)胞（中性分葉核粒細(xì)胞、中性桿狀核粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、異型淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞）。其中，至少有一份樣本含有少量有核紅細(xì)胞，一份含有少量未成熟白細(xì)胞。
按照3.2要求，每份樣本制備5張血涂片，按照第3.3節(jié)所述方法染色，統(tǒng)一標(biāo)簽，但檢驗人員不知道樣本來源。玻片分成5套，每套包含10份樣本的玻片各1張。
3.6.2.2 檢驗人員考核
分發(fā)給參加檢驗的人員一套考核血涂片，要求每張血涂片做200個白細(xì)胞的分類計數(shù)，并根據(jù)血涂片編號，報告結(jié)果，交給監(jiān)考人。監(jiān)考人計算每份樣本每種細(xì)胞的均值，進(jìn)行結(jié)果解釋，制作每種類型細(xì)胞分布圖。其中橫坐標(biāo)（X軸）為組均值（百分率），組均值為實驗室具備資格的檢驗人員計數(shù)的均值。縱坐標(biāo)（Y軸）代表檢驗人員個體的結(jié)果。在圖上添加兩條代表理論上95％和99％可信區(qū)間的線條，由計數(shù)百分率的標(biāo)準(zhǔn)誤算得，計算公式見附錄B。
3.6.2.3 解釋
根據(jù)Gaussian分布假說，5％的個體結(jié)果可能會超出95％范圍，但不會超出99％的限值。
若數(shù)據(jù)不符合該規(guī)則，表示存在樣本處理過程或操作錯誤（如樣本標(biāo)簽錯誤，制片不佳，讀片區(qū)域不當(dāng)或細(xì)胞分類錯誤）。在分析出可能誤差來源后，必須重新進(jìn)行考核。若不能符合統(tǒng)計學(xué)規(guī)則，應(yīng)高度懷疑結(jié)果的有效性。
監(jiān)考人必須仔細(xì)地檢查每張圖形。檢驗人員數(shù)值應(yīng)該呈隨機分布。若非如此，評價中可能引入了檢驗人員的偏倚。應(yīng)該采取糾正措施（如培訓(xùn)或更換人員等），并重新進(jìn)行考核。
應(yīng)保留一套考核血涂片作為標(biāo)準(zhǔn)片，用于其他檢驗人員的培訓(xùn)和考核。
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