電話：
021-67610176傳真：
分離純化處于重組蛋白表達的下游處理（downstreamprocessing）階段，且與上游過程緊密相聯(lián)，如是否帶有親和標簽，是否進行分泌表達等。所以在對目的蛋白表達純化時，要統(tǒng)一考慮和整體設計，并充分考慮上游對下游的影響。同時，不同的表達系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響下游的處理過程：目的蛋白表達是否形成包涵體，目的蛋白表達定位（胞內(nèi)、細胞膜內(nèi)、周質(zhì)空間和細胞外）
由上表可知選擇將所表達的蛋白分泌到細胞外或周質(zhì)空間可避免破碎細胞的步驟，而且細胞外和周質(zhì)空間內(nèi)的蛋白種類較少，目的蛋白易純化；而在細胞質(zhì)內(nèi)表達重組蛋白時，重組蛋白通常是可溶性表達，但也易形成包涵體。可溶性蛋白往往需要復雜的純化步驟，而包涵體易于分離且純度較高，但回收具有生物活性的蛋白質(zhì)卻變得相當困難，通常需要對聚集的蛋白進行變，復性，而通常情況下活性蛋白的得率比較低。德泰生物憑借多年的蛋白表達服務操作經(jīng)驗和相關(guān)的技術(shù)，可以提供可溶性重組蛋白保證型服務和更高純度的上清蛋白。
分離純化原則總結(jié)：
1應盡可能利用蛋白質(zhì)不同物理特性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同技術(shù)多次純化；
2不同的蛋白在性質(zhì)上有很大區(qū)別，每一步純化步驟都應當充分利用目的蛋白和雜質(zhì)成分物理性質(zhì)差異；
3在純化早期階段要盡量減少處理體積，方便后續(xù)純化；
4在純化后期階段，再使用造價高的純化方法，有利于純化材料的重復使用，減少再生復雜性。
色譜法分離純化蛋白質(zhì)
色譜法又稱層析法，是利用不同物理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。所有的色譜系統(tǒng)都由倆個相組成：固定相（固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)上的成分）和流動相（水和其他溶劑）。當待分離的混合物隨流動相通過固體相時，各組分與倆相發(fā)生相互作用（吸附，溶解，結(jié)合）并因作用力的不同導致流出時間上的差異，分部收集流出液，可以得到樣品中所含的各單一組分，從而達到分離各組分的目的。
色譜層析分離純化蛋白質(zhì)有多種方法，包括凝膠過濾色譜，離子交換色譜，親和色譜，疏水色譜液相色譜等。其中親和色譜在重組蛋白純化中的應用中。
親和色譜
原理
親和色譜是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有的特異性親和力，從而達到分離的目的。即將一對能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)、制成專一的親和吸附劑并填充色譜柱，使得樣品混合物流經(jīng)色譜柱時，與親和配基能結(jié)合的物質(zhì)就被選擇性地吸附下來，而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，從色譜柱中流出，使用適當?shù)木彌_液使被分離物質(zhì)與配基解吸附，即可獲得純化的目的產(chǎn)物。
親和色譜具有高選擇性，高分辨率和高容量的特點，并且親和色譜純化過程簡單，迅速，且分離效率高。并且可用于純化生物大分子、稀溶液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白的貯藏、從純化分子中除去殘余污染物等。但其必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求穩(wěn)定色譜的條件，且成本較高。
實驗案例（從E.coli中提取誘導表達的GST標簽融合蛋白）
簡介
谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）親和標簽是純化重組蛋白的常用方法，該方法以GST能夠偶聯(lián)在介質(zhì)上的谷胱甘肽配體結(jié)合為基礎。同時，帶有GST的蛋白與配體結(jié)合是可逆的，能夠在溫和，非變性的條件下通過加入還原型谷胱甘肽被洗脫下來。
材料
BL21感受態(tài)細胞PGEX表達載體LB培養(yǎng)基
Amp（氨芐青霉素）
IPTG
蛋白酶抑制劑
緩沖液1（100mmol/LTris，PH8.5，500mmol/LNaCl）
緩沖液2（100mmol/LNaAc，PH4.5，500mmol/LNaCl）
PBS緩沖液（100mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，1.8mmol/LKH2PO4）
洗脫緩沖液（50mmol/LTris，PH8.0,10mmol/LGSH）
微量紫外分光光度計超聲波破碎儀高速冷凍離心機GST柱
方法
1.載體構(gòu)建和細菌培養(yǎng)
1)采用RT-PCR擴增得到目的基因，構(gòu)建到表達載體（PGEX-4T-1）上；
2)用構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌BL21，LB平板37℃；
3)LB平板上挑取單一菌落接入5mLLB培養(yǎng)基（100ug/mLAmp）中，37℃培養(yǎng)3~5h；
4)將5mL菌液接入1LLB（100ug/mLAmp）液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD60≈0.6，加入0.3mmol/L的IPTG，16℃誘導16h；
5)將培養(yǎng)好的菌液于5000r/min離心10min，棄去上清液，收集菌體，離心后菌體沉淀懸浮于25mLBindingbuffer中。
2.細胞破碎和蛋白分離
1)往懸浮好的菌液中加入適量蛋白抑制劑（10uL的10mg/mLantipain，10uL的10mg/mLleupeptin和1mL的1mol/LPMSF），冰浴放置；
2)超聲破碎，每個循環(huán)26次，超聲6s，間隔5s，視破碎效果共2～4個循環(huán)，破碎后的菌4℃1800r/min
離心30min，上清保持在4℃；
3)GST柱先用PBS緩沖液平衡，上樣結(jié)合30~60min，每5~10min攪拌一次，流干；
4)用2~3倍體積PBS緩沖液平衡清洗非特異性蛋白，流干，加入15mL洗脫緩沖液洗脫；
5)由于殘存少量蛋白酶，洗脫出來的目的蛋白溶液可于4℃保存幾小時；
6)SDS-PAGE檢測初步純化效果，進行下一步純化步驟。
3.蛋白檢測和GST柱的恢復
1)用3倍柱體積的6mol/L鹽酸胍處理柱子10min；
2)用3倍柱體積的水洗柱2～3次；
3)用3倍柱體積的緩沖液1處理柱子10min；
4)用3倍柱體積的緩沖液2處理柱子10min；
5)再次重復3，4步驟倆次；
6)用3倍柱體積的水洗柱2～3次；
7)用3倍柱體積的PBS緩沖液洗柱2次；
8)往柱內(nèi)加3倍體積PBS待用。
4.問題分析及解決方案
GST標簽蛋白不結(jié)合柱子或結(jié)合能力非常弱的原因及解決辦法原因
1)過分的機械裂解使標簽蛋白表性，阻止結(jié)合；
2)GST標簽蛋白在樣品中有聚集，導致沉淀；
3)標簽蛋白濃度過低；
4)標簽蛋白可能改變了GST構(gòu)相；
5)平衡時間過短。
解決方法
1)裂解過程中，采用溫和的裂解條件；
2)在細胞裂解前的緩沖液中加DTT；
3)濃縮樣品，結(jié)合能力依賴濃度；
4)可以通過降低結(jié)合的溫度來改善結(jié)果；
5)確認至少用5倍柱體積的PH6.5~8.0的緩沖液平衡過。
13224517959
