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蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價修飾方式之一。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動、肌肉收縮及腫瘤發(fā)生等過程在內(nèi)的所有生命活動。目前已知有許多人類疾病是由于某些異常的磷酸化修飾所引起，而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導(dǎo)致的后果。在哺乳動物細(xì)胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾；在脊椎動物基因組中，有5%的基因編碼的蛋白質(zhì)是參與磷酸化和去磷酸化過程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修飾本身所具有的簡單、靈活、可逆的特性以及磷酸基團(tuán)的供體ATP的易得性，使得磷酸化修飾被真核細(xì)胞所選擇接受而成為一種zui普遍的調(diào)控手段。鑒于磷酸化修飾在生命活動中所具有的重要意義，探索磷酸化修飾過程的奧秘及其對細(xì)胞功能的影響已成為眾多生物化學(xué)家及蛋白組學(xué)家所關(guān)心的內(nèi)容。用蛋白質(zhì)組學(xué)的理念和分析方法研究蛋白質(zhì)磷酸化修飾，可以從整體上觀察細(xì)胞或組織中磷酸化修飾的狀態(tài)及其變化，這對以某一種或幾種激酶及其產(chǎn)物為研究對象的經(jīng)典分析方法是一個重要的補充，同時提供了一個全新的研究視角，并由此派生出磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)（phosphoproteomics）這一新概念。在蛋白質(zhì)組學(xué)水平進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)的分析定量研究已引起人們廣泛關(guān)注，各種技術(shù)也相應(yīng)地發(fā)展起來。
1. 磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸肽的富集
1.1 免疫親和色譜
富集磷酸化蛋白質(zhì)zui簡單的方法就是用識別磷酸化氨基酸殘基的特異抗體進(jìn)行免疫共沉淀，從復(fù)雜混合物中免疫沉淀出目標(biāo)蛋白質(zhì)。目前，僅有酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的單克隆抗體可以用來進(jìn)行有效的免疫共沉淀。這是因為該抗體具有較強的親和力和特異性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)。Imam-Sghiouar等人從B-淋巴細(xì)胞中通過免疫沉淀獲得酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)，然后再用二維電泳分離技術(shù)并結(jié)合質(zhì)譜分析方法，鑒定出多個與斯科特綜合癥相關(guān)的酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)。由于抗磷酸化絲氨酸和蘇氨酸抗體的抗原決定簇較小，所以令抗原抗體的結(jié)合位點存在空間障礙，特異性較差。因此，目前采用磷酸化絲氨酸/蘇氨酸的抗體來富集磷酸化蛋白質(zhì)的研究相對較 少。
1.2 固相金屬親和色譜（IMAC）
固相金屬親和色譜（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一項較為成熟的磷酸化多肽分離富集技術(shù)。它是利用磷酸基團(tuán)與固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金屬離子的高親和力來富集磷酸肽。目前發(fā)展的高通量磷酸化蛋白質(zhì)組分析途徑主要采用IMAC親和色譜-反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-數(shù)據(jù)庫檢索聯(lián)用的方法。Ficarro等人zui先將IMAC富集技術(shù)應(yīng)用到細(xì)胞系大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的分析中，并從啤酒酵母中鑒定出了216個磷酸化肽段和383個磷酸化位點。該方法的優(yōu)點在于對每個可溶磷酸肽，不管其長度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脫下的樣品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丟失一些與IMAC柱結(jié)合能力較弱的磷酸肽或某些因有多個磷酸化位點而難以洗脫的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段與固相金屬離子也有結(jié)合能力，也可能被富集。為了解決IMAC柱的非特異性吸附的問題，可以采用對羧基進(jìn)行酯化反應(yīng)以及改變洗脫液的體系等方法來提高IMAC柱的特異性。此外，自動化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技術(shù)平臺的研究開發(fā)，使磷酸肽的富集、反相分離和質(zhì)譜檢測都能自動在線進(jìn)行，為IMAC在蛋白質(zhì)組學(xué)中的高通量應(yīng)用開辟了道路。
1.3 TiO2色譜
近期金屬氧化物親和富集技術(shù)得到了人們極大的關(guān)注。2004年，Pinkse等人將二氧化鈦（TiO2）技術(shù)引進(jìn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，利用TiO2與磷酸肽上磷酸基團(tuán)的親和能力實現(xiàn)對磷酸肽的相對富集，并建立了通過TiO2作為預(yù)分離的2D-NanoLCESI-MS/MS 技術(shù)平臺。雖然該技術(shù)在對磷酸化肽段富集時的選擇性和靈敏度方面都優(yōu)于IMAC技術(shù)，但仍然存在非特異性吸附等問題。后來，人們又利用納米材料比表面積大的特點，對TiO2納米級材料進(jìn)行了開發(fā)研究，從而進(jìn)一步增強了該技術(shù)對磷酸化肽段富集的巨大潛力。但是，目前納米級的TiO2富集磷酸化肽段技術(shù)還只能適于MALDI源的質(zhì)譜儀，在ESI源質(zhì)譜儀中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。
1.4 離子交換色譜
離子交換色譜是利用物質(zhì)的帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑的相互作用不同來達(dá)到分離純化的目的。Beausoleil等人發(fā)現(xiàn)大部分磷酸化肽在pH 2.7的溶液中所帶凈電荷是1+，而非磷酸化肽所帶凈電荷大部分為2+，因此，利用強陽離子交換（strong cattion exchange, SCE）技術(shù)就可以將磷酸化肽與非磷酸化肽分離開來。磷酸化肽zui先被洗脫下來，實現(xiàn)相對富集。有人曾利用這一方法分離出了人HeLa細(xì)胞核蛋白的磷酸化肽。但該法也有不足之處，因為有一些磷酸化肽所帶電荷也是2+，甚至帶有更多的電荷，這種情況下就會造成部分磷酸化肽的丟失。
1.5 親/疏水作用色譜
磷酸肽按照其疏水性不同而采用RP-HPLC進(jìn)行分離。RP-HPLC分離是減少混合肽中的復(fù)雜成分的一個十分重要的方法。該方法重現(xiàn)性好、簡單且不需要特別的設(shè)備。極少量的磷酸化肽也可以在低流速下用毛細(xì)管柱分離。需要注意的是，高親水性的磷酸肽可能并未被吸附在柱上而直接流過色譜柱，而高疏水性的肽則會到zui高梯度時才會被洗脫甚至可能不被洗脫，因此在樣本中有些磷酸多肽無法被檢測到。再者，磷酸多肽吸附于金屬表面上，如果使用金屬注射器則可能發(fā)生顯著的樣品丟失。盡管如此，RP-HPLC仍在磷酸多肽分析中得到廣泛的應(yīng)用，這是因為它容易與質(zhì)譜聯(lián)用，并且即使分析物沒有同位素標(biāo)記，也可以在樣本混合物中發(fā)現(xiàn)和描述磷酸化肽。
1.6 磷酸基團(tuán)的化學(xué)修飾
近來，有人將肽或蛋白混合物置于堿性硫代二乙醇溶液中，通過β消除從磷酸化絲氨酸或蘇氨酸中去掉磷酸基團(tuán)H3PO4，形成的雙鍵受到硫代二乙醇的作用，巰基取代磷酸基團(tuán)，生物素與巰基相連，被標(biāo)記的肽或蛋白質(zhì)上樣于固定有親和素的層析柱，通過生物素與親和素的高親和力作用而達(dá)到磷酸化肽或蛋白質(zhì)富集的目的。這一方法的主要缺點在于它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)和肽。Zhou等人用另外一種方法修飾磷酸化肽，用碳二亞胺濃縮反應(yīng)將半胱氨酸加在磷酸基團(tuán)部分，修飾過的肽段以共價鍵與碘乙酰胺樹脂結(jié)合，酸洗滌釋放。此方法既可用于富集磷酸化酪氨酸，可用于富集磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸，但需要多步化學(xué)反應(yīng)和柱純化過程。化學(xué)修飾方法zui大的缺點在于整個過程需要大量蛋白，不利于低豐度蛋白的檢測。
2. 生物質(zhì)譜分析磷酸化位點
用于蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜依電離源的不同分為兩種：基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser-desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（electrosp ray ionization mass spectrometry, ESI-MS）。前者利用基質(zhì)吸收激光的能量使固相的多肽樣品離子化，后者則在噴射過程中利用電場使液相的多肽樣品離子化。離子化的肽段進(jìn)入質(zhì)量分析器，因質(zhì)量電荷比（m/z）差異發(fā)生分離，通過測量肽段離子的相關(guān)參數(shù)，可獲得肽質(zhì)量指紋圖（peptide mass fingerprint, PMF）、肽序列標(biāo)簽（peptide sequence tag, PST）或部分氨基酸序列。zui后，應(yīng)用適當(dāng)?shù)能浖褜せ蚪M和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的定性鑒定及功能分析。
2.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）
MALDI-TOF-MS由于操作簡單、敏感性強、價格低廉而廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)鑒定工作。不過，將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)磷酸化研究就遇到了問題。磷酸化肽段帶負(fù)電荷，而生物質(zhì)譜常用正離子模式，導(dǎo)致離子化程度低；大量非磷酸化肽段的信號抑制了磷酸化肽段的信號并且在肽質(zhì)量指紋圖中缺少標(biāo)志性離子。因而，MALDI-TOF-MS通過與堿性磷酸酶的去磷酸化作用或與氫氟酸相結(jié)合來鑒定磷酸化肽段。絲氨酸和蘇氨酸磷酸化肽段會丟失磷酸基團(tuán)（-98 u），而酪氨酸磷酸化肽段會去磷酸化（-80 u）。MALDI-TOF的另一特征可以進(jìn)行亞穩(wěn)態(tài)裂解分析，即源后衰變（post source decay, PSD）。前離子從離子源內(nèi)解析電離過程中獲得的內(nèi)能在無場漂移區(qū)內(nèi)飛行過程中通過發(fā)生斷裂而釋放其能量，這個過程稱為源后衰變。由此得到的碎片離子與前離子有相同的飛行速度但能量不同，在反射器內(nèi)穿越的深度不一，可被反射器按其質(zhì)量大小（即能量大小）從小到大依次反射，并到達(dá)檢測器檢測。
2.2 串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）
生物質(zhì)譜的質(zhì)量分析器有不同的選擇，如三級四級桿、離子阱、飛行時間、傅立葉回旋共振等質(zhì)量分析器。將兩個質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器串聯(lián)，*個質(zhì)量分析器將預(yù)測組分與其它組分分離，第二個質(zhì)量分析器對其進(jìn)行掃描，產(chǎn)生該組分的質(zhì)譜圖即為串連質(zhì)譜。利用三級四級桿、四級桿-飛行時間、四級桿-離子阱進(jìn)行前體離子掃描或中性丟失掃描，可鑒定磷酸化位點。
前體離子掃描是利用絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化肽段在碰撞誘導(dǎo)解離（CID）時會發(fā)生磷酸基團(tuán)丟失的原理來實施檢測的。這些丟失的磷酸基團(tuán)可以作為磷酸肽的“報告離子”：在陰離子模式下，*個四級桿用來進(jìn)行全譜掃描，CID在第二個四級桿中進(jìn)行，第三個四級桿只選擇通過質(zhì)荷比為79的離子（即PO3-，m/z 79），用來鑒定磷酸化肽段。一旦磷酸化肽段被鑒定出來后，質(zhì)譜便轉(zhuǎn)為陽離子掃描模式，進(jìn)行肽段的測序。前體離子掃描的另一種方式是直接進(jìn)行陽離子掃描，immonium離子（m/z 216.04）是酪氨酸磷酸化肽段的特征性碎片離子。而絲氨酸、蘇氨酸磷酸化肽段涉及到對殘基上的磷酸基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾。在脫磷酸基團(tuán)和發(fā)生β消除反應(yīng)后，加入合成的巰基季銨進(jìn)行加成反應(yīng)，然后在低能量的CID下，產(chǎn)生特異的小分子碎片（m/z 122.06）。
中性丟失掃描在質(zhì)譜檢測磷酸化位點中也有重要地位。在陽離子掃描模式下，絲氨酸、蘇氨酸磷酸化肽段會失去H3PO4或HPO3，從而質(zhì)量數(shù)會減少98u或80 u。中性丟失掃描的優(yōu)點是*可以在陽離子模式下操作，而不像前體離子掃描那樣要變換離子掃描方式，并且此方法在離子阱分析器中也有很好的利用。因為質(zhì)譜檢測到的是質(zhì)量電荷比而不是質(zhì)量本身，所以中性丟失掃描時檢測到的信號可能有幾個數(shù)值。例如，在失去H3PO4的情況下，若離子帶單電荷，則檢測到98 u，若帶雙電荷或三電荷，則會相應(yīng)檢測到49.0 u和32.7 u；在CID時發(fā)生β消除反應(yīng)時，失去的有可能是H3PO4（98 u）也有可能是HPO3（80 u），從而使分析復(fù)雜化。
2.3 傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR MS）
傅里葉離子回旋共振（Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR）質(zhì)譜儀是一種相對較新的質(zhì)譜儀，具有相當(dāng)高的分辨率和準(zhǔn)確性，是幾乎現(xiàn)有的生物質(zhì)譜儀中功能zui強大的一種。FT-ICR的碎片模式是電子俘獲分裂，其原理是照射一束亞熱態(tài)的電子到電噴霧所產(chǎn)生的磷酸化肽段或者小分子蛋白本身，使其形成碎片。zui重要的是磷酸基團(tuán)在電子俘獲分析（electron cap ture dissociation, ECD）中被保留在碎片分子中，使得直接判斷磷酸化位點成為可能。FT-ICR的分辨率*，是其它生物質(zhì)譜的10倍。因而，對于小分子蛋白可以不用酶解而可以直接分析其磷酸化狀態(tài)。這項技術(shù)zui大的缺點在于，必須是較純的樣品才能進(jìn)行ECD分析，而且儀器的價格較為昂貴，對操作人員的技術(shù)要求也較高。
2.4 液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）
色譜的優(yōu)勢在于分離，為混合物的分離提供了zui有效的選擇，但其難以得到物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，主要依靠與標(biāo)準(zhǔn)物對比來判斷未知物，對無紫外吸收化合物的檢測還要通過其它途徑進(jìn)行分析。質(zhì)譜能夠提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，用樣量也非常少，但其分析的樣品需要進(jìn)行純化，具有一定的純度之后才可以直接進(jìn)行分析。因此，人們期望將色譜與質(zhì)譜聯(lián)合使用以彌補這兩種儀器各自的缺點。采用LC-MS結(jié)合SEQUEST運算法則，就可以進(jìn)一步降低樣品的復(fù)雜性，從而能夠?qū)Φ拓S度磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。
3. 定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)
3.1 雙向凝膠電泳
雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析仍然是分離和鑒定蛋白質(zhì)的主要手段。二維電泳（2-DE）根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量、等電點、可溶性及相對豐度來分離蛋白。2-DE結(jié)合敏感銀染方法已成功分離和鑒定了TGF-β和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的大量分子。該方法首先使用泛抗磷酸化絲/蘇氨酸抗體或（和）泛抗磷酸化酪氨酸抗體，富集細(xì)胞被刺激前后的絲/蘇氨酸或（和）酪氨酸磷酸化蛋白分子，進(jìn)行2-DE分離；然后比較刺激前后的圖譜以獲取差異蛋白質(zhì)點；隨后再用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，zui終獲得刺激因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號分子的磷酸化改變，即信號分子是否活化。
在上述基礎(chǔ)上發(fā)展起來的更加敏感且能進(jìn)行定量分析凝膠蛋白質(zhì)點的新方法叫做熒光差異雙向凝膠電泳（fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D DIGE）。它采用熒光試劑來標(biāo)記蛋白質(zhì)并通過熒光成像來獲取電泳圖像。其優(yōu)點是可以在同一塊凝膠上比較兩種處理不同或來源不同的蛋白質(zhì)組表達(dá)，能夠比較地在較寬的動態(tài)范圍內(nèi)使對研究者感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，特別對包括有多組別和多個生物學(xué)重復(fù)情況的研究具有其*的優(yōu)勢。
3.2 熒光染料Pro-Q Diamond dye染色
32P放射性標(biāo)記（32P-labeling）可以非常靈敏、直觀地檢測磷酸化蛋白。早在1991年，該技術(shù)便在研究磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析中表現(xiàn)出了一定的應(yīng)用前景。但32P高放射性對細(xì)胞造成損害并對磷酸化狀態(tài)有影響，此外還存在不能標(biāo)記組織樣本，有放射性污染等問題。熒光染料染色（Pro-Q Diamond）是MolecularProbes公司前幾年推出的一種磷酸化蛋白質(zhì)的熒光染料，它可以直接對聚丙烯酰胺凝膠中的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性染色，無需同位素或特異性抗體，只有通過熒光掃描儀檢測就可以直接顯示出一維或二維凝膠電泳膠上分離的磷酸化蛋白質(zhì)，對非磷酸化蛋白質(zhì)的反應(yīng)性很低，熒光強度會隨著蛋白質(zhì)磷酸化程度的不同而呈現(xiàn)出一定的變化。這種染料與質(zhì)譜兼容，膠上的蛋白質(zhì)點可以通過膠上酶切進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。Chen等人將32P放射性標(biāo)記和Pro-Q染色兩種方法結(jié)合起來分析中國鼠卵巢細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在定量磷酸化蛋白質(zhì)時，結(jié)果受標(biāo)記時間的影響，而且放射性標(biāo)記的磷酸化蛋白質(zhì)與Pro-Q磷酸化染料所染出的磷酸化蛋白質(zhì)之間相關(guān)性較差。Hopper等人分別用2DE-Pro-QDiamond染料方法和32P放射性標(biāo)記方法分析了豬心線粒體中的磷酸化蛋白質(zhì)組，也同樣發(fā)現(xiàn)二者相關(guān)性較差的問題。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，32P標(biāo)記比Pro-Q Diamond方法更靈敏，特別是能更好地檢測那些磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化速率高的蛋白質(zhì)。但是，Pro-Q Diamond對豐度較高但磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化速率較低的蛋白質(zhì)具有更高的靈敏度。然而對于不同的磷酸化位點，Pro-Q Diamond的靈敏度也并非一成不變。
3.3 穩(wěn)定同位素標(biāo)記
2000年，Weckwerth、Willmitzer和Fiehn等人提出穩(wěn)定同位素標(biāo)記（stable-isotope labeling, SIL）與LC/MS結(jié)合使用來進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，從而開辟了定量蛋白質(zhì)組學(xué)的一個新技術(shù)平臺。與傳統(tǒng)的定量方法（如2-DE）相比，穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)在定量準(zhǔn)確度和規(guī)模化定量分析方面都有很大的應(yīng)用前景。在磷酸化蛋白質(zhì)差異定量研究中，目前常用以下幾種穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量方法。
3.3.1 18O標(biāo)記技術(shù)
18O標(biāo)記技術(shù)是將蛋白質(zhì)酶切時或酶切后放入H218O中，在蛋白酶催化作用下將羧基上的兩個氧替換成18O而進(jìn)行的。除了C端肽之外，在適宜的條件下，所有的肽段一般都可以替換上兩個18O，使肽段質(zhì)量數(shù)相差4 u。Korbel等人[29]采取免疫沉淀反應(yīng)/IDE/LC/MS與18O標(biāo)記來分析EPO受體依賴的蛋白質(zhì)，鑒定并定量了187個磷酸化蛋白，發(fā)現(xiàn)89個蛋白質(zhì)上的酪氨酸以EPO受體依賴的方式發(fā)生變化。18O標(biāo)記技術(shù)是一種操作簡單、條件溫和、應(yīng)用廣泛（trypsin、chymotrypsin、lys-C和glu-C都能被用來標(biāo)記酶切肽段的C端），并且沒有副產(chǎn)物的標(biāo)記技術(shù)。它能與多種磷酸化肽段富集方法連用，適于低豐度磷酸化肽段的定量標(biāo)記。目前，18O標(biāo)記技術(shù)已得到上一些大型實驗室的青睞。但是，用18O進(jìn)行同位素標(biāo)記經(jīng)常產(chǎn)生標(biāo)記一個氧原子和兩個氧原子不等的現(xiàn)象，即產(chǎn)生分子質(zhì)量+2和+4兩種混合的產(chǎn)物。此外，18O與16O 交換速率也依肽段的大小、氨基酸的類型、酶的類型以及肽段序列而有所變化。所以，盡管該技術(shù)已經(jīng)得到比較普遍的應(yīng)用，但是要得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果還需對其進(jìn)一步優(yōu)化。
3.3.2 同位素代謝標(biāo)記技術(shù)
15N標(biāo)記法（15N labeling）是Oda等人zui早提出的一種同位素代謝標(biāo)記技術(shù)，它是在培養(yǎng)基中分別摻入14N和15N來尋找差異表達(dá)蛋白的一種方法。雖然該方法非常適用于追蹤單個磷酸化位點的動力學(xué)變化，但它于分析那些表達(dá)水平相對較高的蛋白質(zhì)。
SILAC（stable isotope labeling by amino acid in cellculture）技術(shù)[25]出現(xiàn)以后，很快取代了15N標(biāo)記法。SILAC技術(shù)，即細(xì)胞培養(yǎng)過程中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記，具有顯著的優(yōu)點（表2），因而迅速獲得認(rèn)可并在實驗室中廣泛使用。已經(jīng)使用過的穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸有精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）和亮氨酸（Leu）等。
3.3.3 化學(xué)標(biāo)記技術(shù)
目前，化學(xué)標(biāo)記技術(shù)發(fā)展的基本化學(xué)原理主要有針對肽段上磷酸基團(tuán)的β消除-馬氏加成反應(yīng)和在羧基端的酯化反應(yīng)以及氨基端的酰化反應(yīng)。其中，β消除-馬氏加成反應(yīng)用得，其基本原理是使磷酸化肽段的磷酸基團(tuán)在堿性環(huán)境下發(fā)生β消除形成雙鍵，同時用標(biāo)有不同同位素的親核試劑與雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)以取代磷酸基團(tuán)。該技術(shù)是專門針對磷酸化肽段而建立的，但較多的化學(xué)修飾以及純化步驟，造成了大量樣本的損失，而且在沒有預(yù)分離和處理的情況下，該反應(yīng)對O-糖基化肽段也起反應(yīng)，所以在結(jié)果中將導(dǎo)致兩種類型肽段的混淆。Thompson等人將IMAC技術(shù)與β消除-馬氏加成反應(yīng)結(jié)合來分析定量磷酸化蛋白質(zhì)。他們首先用IMAC親和富集磷酸化肽段，然后用堿性溶液令磷酸化肽段發(fā)生β消除，與此同時磷酸化肽段也被洗脫下來，接著進(jìn)行馬氏加成反應(yīng)從而標(biāo)記上含有不同同位素的標(biāo)簽。 各種各樣的化學(xué)修飾技術(shù)為磷酸化蛋白質(zhì)的定量帶來了可喜的前景，但這些化學(xué)修飾方法本身固有的反應(yīng)效率、副產(chǎn)物等問題以及在大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)定量研究中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。
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