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Part I：天然抗體庫構建、免疫抗體庫構建、多種片段抗體庫構建、抗體人源化
1、技術路線
外周血淋巴細胞/脾細胞?提取RNA/gDNA?PCR出全套抗體片段（Fab、scFv等）?隨機重組插入噬菌體外殼蛋白?感染大腸桿菌?抗體片段展示于噬菌體表面?抗原特異性篩選?富集有效結合克隆?擴增結合力強的克隆。
2、技術應用（主要在醫(yī)學口）
（1）在寄生蟲醫(yī)學中的應用（如瘧原蟲、吸血蟲等），進行診斷試劑與疫苗的開發(fā)，例如分子疫苗制備、保護性抗原制備。
篩選抗靶蛋白抗體可變區(qū)---研究蛋白分子免疫識別---篩選診斷試劑/篩選新型疫苗 例子：篩選抗寄生蟲抗原的鼠源抗體scFv可變區(qū)片段，進一步研究抗原結構和功能，后續(xù)可以制備治療用和診斷用的抗體。
優(yōu)勢：人源化的抗體/抗體片段可通過工程菌進行大量生產，降低成本。
（2）在醫(yī)學微生物中的應用（已獲得針對HAV、HBV、HCV、HIV、VZV、RSV、風疹病毒、CMV、流感嗜血桿菌和破傷風毒素、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒糖蛋白、TNF-alpha等的單抗） 作為診斷試劑、治療藥物的開發(fā)工具。
成功案例：對病毒性肝炎診治，對肝炎臨床診斷、基因治療、發(fā)病機制研究研究提供工具 （3）細胞內免疫：針對病毒或腫瘤抗原表達
例子：將篩庫得到的高親和力抗體的scFv基因導入哺乳動物細胞，通過表達的抗體與靶抗原結合阻止病毒生成、干擾腫瘤細胞的代謝。 （4）血液心血管系統(tǒng)研究
例子：血栓類心血管疾病研究：血栓形成導致多種心血管疾病，使用噬菌體篩庫得到的抗人纖維蛋白單鏈抗體可用于血栓性疾病的定位診斷、導向性溶栓治療。優(yōu)勢：單鏈抗體分子量小（抗體的zui小活性單位）、組織穿透力強、體內清除快、集中針對目標組織。 例子1：血液類：EPO為治療貧血多肽藥物，篩庫得抗EPO單鏈抗體，用于獲得重組buEPO及研發(fā)EPO檢測試劑盒。
例子2：血液類：構建50AMcAb單鏈噬菌體抗體庫，研發(fā)原核表達的血型鑒定抗體試劑；構建抗人紅細胞單鏈抗體scFv，與ABO血型無關，用于快速血凝診斷 （5）自身免疫疾病研究（重癥肌無力、Grave’s病、喬本氏甲狀腺炎等） 研究人體自身抗體1
的分布、基因構建、遺傳規(guī)律、產生機制及自身抗原2的性質
自身抗體是指針對自身組織，器官、細胞及細胞成分的抗體。正常人體血液中可以有低滴度的自身抗體，如果自身抗體的滴度超過某一水平，就可能對身體產生損傷，誘發(fā)疾病。優(yōu)勢：容易操作，可大量制備，抗體人源化。已發(fā)現(xiàn)的64株IgG類自身抗體中有49株是噬菌體抗體庫技術得到的
其他自身免疫疾病研究：干燥綜合征、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、魏格納氏肉芽腫
（6）腫瘤研究及藥物靶向治療
利用腫瘤相關抗原TAA或腫瘤特異性抗原TSA從噬菌體抗體庫中篩選，得到的單鏈可變區(qū)抗體分子量小，組織滲透性強，可用于體內造影診斷、免疫治療抗體藥物開發(fā)。 優(yōu)勢：噬菌體抗體庫篩選的TAA TSA抗體具有親和力強、特異性高的特點，可用于靶向治療 例子：從HBx（肝癌相關抗原）單抗細胞中克隆重鏈可變區(qū)基因，重組入M13噬菌體，驗證表達產物具有活性，然后表達出單鏈抗體、單域抗體或嵌合抗體，為肝癌導向治療研究提供基礎。
（7）弱免疫原性物質的特異性抗體制備：
制備一些很難獲得的抗體，如特異性識別MHC I類分子-抗原肽復合物的抗體、胸腺上皮抗體、雌激素抗體等。 （8）食品安全、環(huán)境安全檢測
例子1：以致癌物質黃曲霉素偶聯(lián)物免疫小鼠，制備小鼠源性抗黃曲霉素單鏈抗體ScFV庫，篩選高親和力抗體，可用于對花生等進行食品安全檢測
例子2：以除蟲菊酯偶聯(lián)物免疫小鼠，構建噬菌體抗體文庫并篩選抗除蟲菊酯的高親和力抗體，對監(jiān)測環(huán)境中農藥殘留、提高種植業(yè)科學用藥具有重要意義 總結：
噬菌體抗體庫構建這塊，大多應用于醫(yī)學相關研究，客戶主要集中于醫(yī)院中設立的研發(fā)機構，且大多涉及到人源化改造，其次也有些科研用戶，比如高校或研究所的醫(yī)學生物相關專業(yè)，研究與疫病、自身免疫等相關科室，會用到動物自身抗體來做研發(fā)，另外還有一類，也是目前我們準備研發(fā)的項目，前景較大，跟組學相關聯(lián)，客戶在組學這塊做完差異蛋白鑒定之后，在眾多差異蛋白中無法確定優(yōu)先做哪些蛋白，但是又想進一步研究蛋白表達差異時，需要制備較多抗體，可借用我們構建的鼠抗體庫或者兔抗體庫，實現(xiàn)大規(guī)模蛋白的抗體篩選，可zui大程度的降低成本和周期。
Part 2： 噬菌體隨機多肽庫
1、技術路線
多肽序列設計? DNA序列?插入噬菌體外殼蛋白?感染大腸桿菌?抗體片段展示于噬菌體表面?抗原特異性篩選?富集有效結合克隆?擴增結合力強的克隆。
2、技術應用
（1）蛋白相互作用
能誘導宿主發(fā)生自身應答的物質稱為自身抗原。正常情況下免疫系統(tǒng)對自身物質不作為抗原來對待，但當機體受到外傷或感染等刺激時，就會使隱蔽的自身抗原暴露或改變自身的抗原結構，或者免疫系統(tǒng)本身發(fā)生異常，這些情況均可使免疫系統(tǒng)將自身物質當作抗原性異物來識別，誘發(fā)自身免疫應答，引起自身免疫病。
研究互作蛋白間氨基酸殘基的特征，為蛋白質相互作用和功能基因組學的研究提供工具。例如對功能蛋白的“熱點”-蛋白互作的zui小功能域-進行鑒定，鑒定重要生物大分子如生長激素受體、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）受體的激動劑和拮抗劑，這類多肽定義為熱點配體HSPL。
例子1：Pillulta用高度多樣性的隨機肽庫噬菌體文庫進行篩選，分離出10個能競爭性結合胰島素受體的多肽，并且與胰島素無序列同源性，通過競爭鑒定實驗確定了這些多肽在胰島素分子上的結合位點及對應激活的酶活性類型和激動劑、拮抗劑功效。
例子2：TNF-α和TNF-β具有防御感染的左右，其生物學效應由膜受體TNFR1(p55)和TNFR2(p75)來介導，用TNFR2(p75)篩選肽庫分離到了4個與TNFR2特異性結合HSPL肽，其中有3個能誘導靶細胞的細胞毒反應。
（2）腫瘤相關抗原研究
鑒定分析腫瘤細胞或腫瘤血管內皮表達的特異性癌細胞抗原的結構和功能，對腫瘤的早期診斷和靶向治療有重要意義。例如篩選腫瘤相關抗原、尋找具有治療作用的靶肽等。 例子1：用胃癌單抗MG7-Ab對隨機肽庫進行篩選，得到相對保守的表位信息，為研究單抗與胃癌相關抗原MG7-Ag的結合的結構奠定基礎
例子2：抗腫瘤單抗分子量大，組織滲透力差且易被肝、單核巨噬細胞系統(tǒng)非特異性吸收，肽類藥物可以克服這些缺點。用人B細胞淋巴癌細胞系SUP-88表面*性進行篩庫，得到一系列現(xiàn)行肽基元，其中一些短肽以二聚體或四聚體形式呈遞給完整細胞時能激發(fā)信號轉導誘導細胞凋亡。
例子3：用前列腺癌特意性抗原PSA篩選肽庫鑒定到的配體肽與PSA的結合受鋅離子影響，有發(fā)展為治療制劑的潛力。
（3）疫苗研制
噬菌體肽庫能篩選到一些抗原的模擬表位，這些模擬抗原還具有一定的免疫原性，能刺激機體產生免疫反應，產生的抗體能與真正的病原體上的天然表位反應，這有利于將發(fā)現(xiàn)的表位作為人工合成疫苗的一個組分，在疫苗設計方面有廣泛的應用前景。
例子：為解決非典型嗜血流感桿菌毒力因子表面蛋白混合寡糖LOS制備疫苗遇到的免疫原型弱的問題，用兔抗LOS篩選肽庫，得到4個一致性序列，其中3個與兔抗親和力高。用篩選得到的3個高親和力肽免疫兔得到的抗體對染病小鼠模型具有抗體保護性作用。 總結：
噬菌體隨機肽庫，zui主要的應用，就是研究互作，不管是天然組織、細胞或者蛋白，還是重組的蛋白及合成的多肽，想了解與其互作的克隆序列，進而結合物種內蛋白序列進行分析，確認可能互作的蛋白信息，其次就是獲取抗原表位序列，抗原決定簇一般由5-12個aa組成，通過抗體對多肽庫的篩選，獲得對應表位的序列，為疫苗研發(fā)等工作提供依據
Part 3雙特異性抗體BsAb
1、技術應用
（1）導向免疫治療
雙特異性抗體主要應用于腫瘤的治療中，它一方面能夠結合免疫效應細胞表面的激活分子（能激活效應細胞如T細胞、NK細胞）或偶聯(lián)毒素，另一方面結合腫瘤相關抗原TAA，從而發(fā)揮對腫瘤細胞的殺傷作用。
例子1：用長春花堿的BsAb注射入荷瘤小鼠，腫瘤的生長受到明顯抑制
例子2：在體外實驗中，用抗CD3-抗HIV的BsAb武裝的T淋巴細胞能對HIV感染的靶細胞產生顯著的細胞毒效應，且不受HIV的制約，所以健康人的T細胞有望用于HIV患者的治療。 例子3：用抗CD3-抗腫瘤的BsAb與淋巴因子激活的殺傷LAK細胞結合起來治療神經膠質瘤患者，兩年存活率相比于只是用LAK細胞的一組明顯升高。
（2）免疫學診斷
抗靶抗原-抗標記酶的BsAb能用一步法簡化檢測流程，在免疫檢測方面有優(yōu)勢
例子1：免疫組織學標記過程中，使用BsAb與標記酶分步加樣，因為BsAb分子量小，組織穿透力強，故能提高檢測靈敏度
例子2：魏巍制備的針對人膀胱移行細胞癌的BsAb具有良好特異性，對正常膀胱粘膜組織和腺癌組織切片均未顯色。
例子3：抗HCG和抗脲酶的BsAb在夾心ELISA中HCGzui低檢出限為25U/L，與相應的酶抗體檢測結果相當，此抗體與酶結合物在4 ℃穩(wěn)定性達數(shù)月之久。將抗體與某些酶基因相連，表達出的酶標抗體可直接用于檢測和示蹤研究
在影像學診斷方面，BsAb能有效提高放射性標記物對病變部位的趨向性，減少對正常組織的損害。
例子4：用放射性碘標記的抗CEA片段分別與單價scFv、scFv二聚體、scFv-CH3微型抗體結合，對LS174T荷瘤無胸腺小鼠進行腫瘤靶向和生物分布研究，scFv-CH3微型抗體的藥代動力學和清除特性適中，適合定位顯影。
例子5：將CEA/HSG BsAb聯(lián)合PET和SPECT應用于肺內微轉移的人結腸癌裸鼠分子顯影中，該CEA/HSG BsAb具有高度靶向定位特性。
（3）免疫性疾病治療中的應用 過敏性疾病中的應用：
例子1：Tam發(fā)現(xiàn)IgE/Fcy II BsAb不會引發(fā)IgE致敏細胞中組胺的釋放，它能阻止引發(fā)組胺釋放的特定抗原的觸發(fā)，同時抑制肥大細胞和嗜酸性粒細胞的活化，能應用于過敏性疾病的治療。
例子2：Lum發(fā)現(xiàn)CD3/CMV BsAb能夠靶向T細胞，可以用來預防和治療造血干細胞移植后的巨細胞病毒感染。
總結：
雙特異性抗體，主要應用方向也是在靶向治療上面，雙特異性，顧名思義有2個抗體靶向，一個用于定位，一個用于消除，真正做診斷靶向級別的客戶，一般不會選擇定制，如果只是研發(fā)方向，為寫文章，這個都是可以做的，所以客戶群體相對分散，有意向咨詢可再做詳細跟進。
Part 4 參考文獻
2.張勇. 基因工程抗體中噬菌體抗體庫技術的應用, 生物學雜志. 2002,5(19):35-37.
3.楊乃娣, 詹金彪. 噬菌體抗體庫技術及其研究進展, 細胞生物學雜志.2009,31(5):629-634.
4.肖創(chuàng)清, 黃志紅.雙特異性抗體的臨床應用進展,放射免疫學雜志.2013,26(5):587-589. 5.李芳秋, 朱扣軍. 噬菌體展示肽庫技術應用的研究進展, 武建國醫(yī)學研究生學報. 2004,9(17):843-846.
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