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細胞培養(yǎng)基本概念
細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長繁殖，并維持其結(jié) 構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個細胞，也可以是細胞群。
細胞培養(yǎng)目的與用途
1、科學研究：藥物研究開發(fā)與基礎研究 藥物研究與開發(fā)
(1) 新藥篩選：如化學合成藥物藥效研究、中藥有效成分篩選與鑒定等。
(2) 疫苗研究與開發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開發(fā)（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫 瘤疫苗(多肽疫苗)等。
(3) 基因工程藥物研究與開發(fā)：如干擾素研究與開發(fā)，細胞生長因子研究與開發(fā)等。
(4) 細胞工程藥物研究與開發(fā)：生物活性多肽研究與開發(fā)，人參皂甙、紫杉醇等生物活 性成分研究與開發(fā)。
(5) 單克隆抗體制備：包括診斷用單克隆抗體，治療用單克隆抗體。
基礎研究
(1) 藥物作用機理
(2) 基因功能
(3) 疾病發(fā)生機理
2、 生物制藥
(1) 疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)
等。
(2) 基因工程藥物生產(chǎn)：如在臨床醫(yī)學中具有治療價值的一些細胞生長因子如干擾素、 粒細胞生長因子、胸腺肽等
(3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)
(4) 細胞工程藥物生產(chǎn)：生物細胞內(nèi)的一些生物活性多肽，生物活性物質(zhì)等
細胞培養(yǎng)基本條件
1、合適的細胞培養(yǎng)基
合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的zui重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng) 和促使細胞生長增殖的基礎物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。
2、血清
目前，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細胞培養(yǎng)液中zui重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分。
3、無菌無毒細胞培養(yǎng)環(huán)境
無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng) 的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者 自身代謝物質(zhì)積累，可導致細胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細胞時，必須保持細胞 生存環(huán)境無菌無毒，及時清除細胞代謝產(chǎn)物。
4、恒定的細胞生長溫度
維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。
5、合適的氣體環(huán)境
氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。
細胞培養(yǎng)基種類與基本成分
細胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（目前使用的培養(yǎng)基 絕大部分是合成培養(yǎng)基），按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基 需由實驗者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直接使用，非常方便。 每種細胞都有其合適的培養(yǎng)基，詳見附表 1。
1、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無機鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)
氨基酸
氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨 基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨
酰胺是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。
因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應 置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在 4℃冰箱中儲 存 2 周以上時，還應重新加入原來量的谷氨酰胺。
碳水化合物
碳水化合物是細胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。
無機鹽
培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡。此外，通過提供鈉，鉀和鈣 離子，幫助細胞調(diào)節(jié)細胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個非常重要的因素, 細胞通常可耐 受 260mOsm/kg −320 mOsm/kg。標準培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動。特別注意：向培 養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強酸或強堿中的物 質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加 HEPES 時需按以下方法調(diào)節(jié)鈉離子濃度。
緩沖系統(tǒng)
大多數(shù)細胞所需 pH 在 7.2 - 7.4。但是，細胞培養(yǎng)zui適 pH 值隨培養(yǎng)的細胞種類不同而 不同。成纖維細胞喜歡較高 pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉(zhuǎn)化細胞系則需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。 由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與 CO2 體系進行緩沖，因此，氣相中的 CO2 濃度 應與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中 CO2 濃度設定在 5％，培養(yǎng)液中 NaHCO3 的加入量為 1.97g/L；如果 CO2 濃度維持在 10％，培養(yǎng)液中 NaHCO3 的加入量為 3.95g/L。細胞培養(yǎng)瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。
HEPES 是一種非離子緩沖液，在 pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，但是非 常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L） 共用，以抵消因額外加入 HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的 蓋子應擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作 為 pH 指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。
維生素
在細胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以 適合更多的細胞系生長。
其它成分
在一些較為復雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的 DMEM 培 養(yǎng)液，使用時還需要補加丙酮酸鈉和 2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 對細 胞生長有很重要的作用。有人認為它相當于胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氫基，其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘 導細胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養(yǎng)細胞的損害。另一個重 要作用是促進分裂原的反應和 DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉(zhuǎn)化作用， 已廣泛應用于雜交瘤技術(shù)，另外，也開始用于一些難以培養(yǎng)的細胞。2-Me 是一種小分子 還原劑，極易氧化。分子量為 78.13，純的 2-Me 是一種無色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為 5×10-5M。常配制成 0.1M 的儲存液，用時每升培養(yǎng)液 加 0.5ml。
液體培養(yǎng)基保存：
液體培養(yǎng)基應于 4℃冰箱避光保存，實驗前放入 37℃預熱。未加血清液體培養(yǎng)基有 效期為 12 個月。液體培養(yǎng)基中的 L-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果 細胞生長不良，可以再添加適量 L-谷氨酰胺。
干粉培養(yǎng)基保存：4℃冰箱避光保存，有效期 36 個月。
血清
細胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是zui常用的血清， 分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格 昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一 點，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛 中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。
血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細 胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞 生長的物質(zhì)。因此，在購買大量血清之前，必須對血清支持細胞生長能力進行檢測，然后再，然后大量購買質(zhì)量好的同一批號的血清，并注意以下幾點：
（1）需要長期保存的血清必須儲存于-20℃ – 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切 勿超過 1 個月。由于血清結(jié)冰時體積會增加約 10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前， 必須預留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。
（2）一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則可將血清 加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾，切勿直接過濾血清。
（3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入 4℃冰箱 中溶解 1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均 勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20℃進入 37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。
（4）熱滅活是指 56℃, 30 分鐘加熱已*解凍的血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此 熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作 此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會影響血清的質(zhì)量。補體 參與反應有：細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬 作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞發(fā)生化學趨化和活化。
（5）切勿將血清在 37℃放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破會 而影響血清質(zhì)量。
（6）血清中的沉淀物 絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量。可用離心 3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。
顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物 在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影 響細胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清。
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